Ерохин унижает бету в его же группе три

СУКА, КАК МОЖНО СЕРЬЕЗНО ОБСУЖДАТЬ ЭТОТ ФАНФИК ПОЕХАВШЕЙ ЖИРУХИ/ПИДОРА? Вы совсем охуели? Очевидно же, блядь, очевидно, что вся эта нереалистичная уебищная графоманская хуйня - порождение ванаби-писаки-хуи-сосаки. Как будто пиздой яойщицы по бумажке повозили, а потом всю эту слизь выложили в печатном виде. Ебал я вас в рот, пидорофанфики и получше бывают, без всех этих ебучих клише прищуренные ниабычные зеленые глаза со смешинкой или он посмотрел на меня игриво и лукаво.

>>63422310
Сажа отвалилась.

>>63422551
Потому что тогда ты не лучше жирной пизды-яойщицы, да еще и обладаешь полным отсутствием вкуса, ведь такая графоманская хуета с Лисенка и прочими волнительными нежностями, суть который сводится к загонянию хуев в жопу - удел припизднутых феечек, которые себе даже в жопу ничего не совали.

>>63424497
Да пошла ты нахуй, протечная пизда. Сфотографировала руку, все, теперь я кун. Хуй с пруфом давай, жирная блядь.

>>63424779
>с сапом
Чому я такое уебище? Самофикс.

>>63424834
Подразумевая, что можно попросить какого-нибудь брата, мудило. Что, хуй слабо выложить, склизкая дыра?

>>63424979
Неграмотная жируха выдумывает проблемы, спешите видеть. Русский язык учи, пизда, а то твои говнофанфики читать не будут.

>>63425058
Он провел пальцем по моим губам, тихонько успокаивающе зашептал мне на ухо. Затем стал аккуратно, кончиками пальцев гладить мои губы, шею, ключицы. Я невольно ответил на его ласки, в животе как будто разгорелся пожар, я потянулся к ему и начал судорожно целовать к шею и подбородок.
А нормальный гей написал бы, что у него хуй стоял как каменный, пока Ерохин драл его раком.

>>63425256
А оп, например, не пидорас, а склизкая дырень, текущая от гомоебли.

>>63425339
Вся соль в том, что ты текущая манда, так что пошла нахуй, мразина. Охуеть, вся суть гомоебли в засовывании хуя в жопу, ну обосраться, это так неочевидно, блядь. Но ты же жируха, у тебя вся суть в любви и страданиях уровня пятого класса.

Плазми
ды — небольшие молекулы ДНК, физически отдельные от геномных хромосом и способные реплицироваться автономно. Как правило, плазмиды встречаются у бактерий и представляют собой двухцепочечные кольцевые молекулы, но изредка плазмиды встречаются также у архей и эукариот.
В природе плазмиды обычно содержат гены, повышающие устойчивость бактерии к неблагоприятным внешним факторам (в т. ч. устойчивость к антибиотикам), нередко они могут передаваться от одной бактерии к другой (иногда даже к бактерии другого вида) и, таким образом, служат средством горизонтального переноса генов.
Попадание плазмиды в клетку может осуществляться двумя путями: либо при непосредственном контакте клетки-хозяина с другой клеткой в процессе конъюгации, либо путём трансформации, то есть искусственное введение в клетку плазмиды, которому предшествует изменение экспрессии определённого гена клетки-хозяина (приобретение клеткой компетентности).
Искусственные плазмиды используются как векторы в клонировании ДНК, причём благодаря их способности к репликации обеспечивается возможность репликации рекомбинантной ДНК в клетке-хозяине.
Размер плазмид варьирует от 1 до свыше 1000 тысяч пар оснований[1]. Количество идентичных плазмид в пределах одной клетки изменяется от одной до тысяч в зависимости от дополнительных обстоятельств. Плазмиды можно считать частью мобилома, поскольку они часто передаются при конъюгации — механизме горизонтального переноса генов.
Впервые термин плазмида (англ. plasmid) был предложен американским молекулярным биологом Джошуа Ледербергом в 1952 году

Плазмиды характеризуются различной величиной. Если самые маленькие плазмиды содержат менее 2 тысяч пар оснований, то мегаплазмиды включают сотни тысяч пар оснований (обычно до 600 тыс.). В этом случае уже сложно провести чёткую границу между мегаплазмидой и минихромосомой. Некоторые виды бактерий могут одновременно содержать множество различных плазмид, так что их суммарный генетический материал превосходит по размеру таковой у самой бактерии. Например, симбиотическая почвенная бактерия Sinorhizobium meliloti содержит 3 репликона размером 3,65, 1,68 и 1,35 миллионов пар оснований (Mbp) соответственно вдобавок к её собственной хромосоме (6,69 Mbp)[3]. Соответственно изменяется и молекулярная масса плазмид — от 1,5 до 200 МДа, а также количество кодируемых плазмидами белков — от 1—2 до 200[4].
Количество плазмид на одну клетку также варьирует. Если у некоторых плазмид число копий на клетку составляет одну или несколько, то у других, главным образом мелких, плазмид их число может доходить до десятков и даже сотен. Численность плазмид зависит от характера их репликации[3]. Плазмиды способны реплицироваться независимо от хромосомы, однако они могут находиться под строгим или ослабленным контролем от неё. В первом случае плазмида реплицируется синхронно с хромосомой, и численность таких плазмид невелика (1—3). К плазмидам с ослабленным контролем репликации относят мелкие плазмиды[5]. Конкретные механизмы репликации плазмид рассматриваются ниже.

Геометрия[править | править исходный текст]
Хотя большинство плазмид представляют собой кольцевые молекулы, в настоящее время известно много примеров бактерий с линейными плазмидами. Поскольку линейным плазмидам необходим механизм репликации концов, которого нет у кольцевых хромосом, линейные плазмиды обычно имеются у бактерий с также линейными хромосомами[6].
Кольцевые плазмиды могут иметь более одной топологической конфигурации, что обеспечивается соотношением противоположного действия ДНК-гираз и топоизомераз. Обычно плазмидная ДНК находится в виде ковалентно замкнутого суперскрученного кольца. Если одна из цепей ДНК претерпевает разрыв, то суперскрученная плазмида расплетается в простое кольцо, которое при электрофорезе медленнее, чем суперскрученная форма, проходит через агарозный гель. Если разрыв претерпевают в противоположных позициях обе цепи ДНК, то образуется линейная форма. Вдобавок из-за гомологичной рекомбинации плазмидные мономеры могут объединяться в димеры, которые из-за своих более крупных размеров медленнее мономеров проходят в агарозном геле при электрофорезе. Явление различной скорости прохождения различных форм плазмид через агарозный гель при электрофорезе используется для их электрофоретического разделения.
В нижеследующей таблице приведены некоторые таблицы и их основные физические характеристики[3].
Плазмида Хозяин Размер плазмиды
(тыс. пар оснований) Геометрия плазмиды Число копий плазмиды
на клетку
pUB110 Bacillus subtilis 2,3 Кольцевая 20—50
ColEl Escherichia coli 6,6 Кольцевая 10—30
lp25 Borrelia burgdorferi 24,2 Линейная 1—2
pNOB8 Sulfolobus sp.a
(архея) 41,2 Кольцевая 2—40
F Escherichia coli 99,2 Кольцевая 1—2
SCP1 Streptomyces coelicolor 350,0 Линейная 4
pSymA Sinorhizobium meliloti 1354,2 Кольцевая 2—3

Репликация плазмид[править | править исходный текст]

Как отмечалось выше, важным свойством плазмид является их способность к автономной репликации, в той или иной мере проходящей под контролем хромосомы. Этот контроль обусловлен тем, что плазмиды содержат не все необходимые для репликации гены, и поэтому в их репликации также принимают участие некоторые ферменты клетки[5]. Механизмы этого контроля подробнее освещены ниже.
Этапы репликации[править | править исходный текст]
В репликации плазмид выделяют 3 этапа:
инициация;
элонгация;
терминация.
Так как ДНК-полимераза не может начинать репликацию de novo, то есть с нуля, для начала её работы требуется затравка — праймер. Эта проблема решается следующими способами:
Открытие цепей и последующее РНК-праймирование (репликация по тета-механизму или репликация по механизму замещения цепи);
Разрыв одной из цепей с образованием свободного 3'-ОН конца (репликация по типу катящегося кольца).
Наиболее часто инициация катализируется несколькими инициаторными белками, кодируемыми плазмидой, которые узнают определённый сайт на ДНК плазмиды и таким образом определяют точку начала репликации (Ori). В некоторых случаях эти белки также непосредственно участвуют в создании праймера. Они также могут играть роль направляющих белков в сборке реплисомы плазмиды.
Элонгацию обычно осуществляет голофермент ДНК-полимераза III (в некоторых случаях на ранней стадии — ДНК-полимераза I) при участии некоторых белков хозяйской клетки, входящих в состав реплисомы.
Для наступления терминации репликации плазмиды требуется набор необходимых условий, как и для возможной последующей реинициации[7].

Контроль репликации[править | править исходный текст]
Механизмы контроля репликации работают на стадии инициации репликации. Этот контроль обеспечивает поддержание определённой численности плазмид в популяции бактерий. Молекулы, непосредственно его осуществляющие, могут быть:
РНК с противоположной полярностью;
последовательности ДНК (итероны);
РНК с противоположной полярностью вместе с белками.
Эти механизмы поддерживают определённую частоту циклов репликации на плазмиду в данной клетке и способны чувствовать отклонения от этой частоты[7].
Механизмы репликации[править | править исходный текст]
Репликация по тета-механизму[править | править исходный текст]
См. также: Тета-структура
Этот механизм хорошо изучен в основном у плазмид грамотрицательных бактерий, хотя такой механизм описан и у плазмид грамположительных бактерий: плазмид стрептококков/энтерококков семейства Inc18, некоторых репликонов лактококков и у как минимум одной плазмиды Bacillus subtilis.
Репликация по тета-механизму включает в себя следующие этапы:
Расплетание двух родительских цепей;
Синтез праймерной РНК (пРНК) на каждой из них;
Инициация репликации при помощи ковалентного нарастания пРНК на каждой из них.
Синтез комплементарной цепи ДНК на каждой из родительских цепей. Одна из цепей при этом выступает лидирующей, другая — отстающей, хотя синтез цепей происходит одновременно.
Тета-репликация может начинаться одновременно с одной или нескольких точек и быть при этом одно- или двунаправленной. В электронный микроскоп репликационная структура выглядит как греческая буква Θ (тета), отчего она называется тета-структурой. Если же специальные ферменты разрезают эту структуру в точке начала репликации, по получается Y-образная структура («вилка»). Репликационные структуры также можно определить при одно- или двумерном электрофорезе. Этот анализ позволяет установить природу репликационных соединений, направление репликации, точки начала и конца репликации, угол между лидирующей и отстающей цепями.
За редкими исключениями плазмидам с тета-типом репликации необходим кодируемый плазмидой инициаторный белок Rep. Некоторые репликоны на ранних этапах репликации также нужнаются в ДНК-полимеразе I хозяйской клетки[7].

Репликация по механизму замещения цепи[править | править исходный текст]


Модель, иллюстрирующая репликацию по механизму замешения цепи
Наиболее известым примером плазмид с репликацией по механизму замещения цепи являются плазмиды семейства IncQ, чьим прототипом является плазмида RSF1010. Членам этого семейства для репликации необходимы 3 белка, кодируемые плазмидой. Эти белки запускают инициацию репликации в каждой из двух точек начала репликации, локализованных симметрично по одной на каждой цепи ДНК.
Сущность механизма замещения цепи заключается в том, что новосинтезированная цепь ДНК, комплементарная одной из родительских цепей, вытесняет одну из родительских цепей. В результате образуется одноцепочечная кольцевая ДНК (вытесненная родительская цепь) и суперспирализованная двуцепочечная ДНК (комплементарные друг другу оставшаяся родительская цепь и дочерняя). В дальнейшем двуцепочечная структура одноцепочечной кольцевой ДНК восстанавливается[7].
Репликация по типу катящегося кольца[править | править исходный текст]
Основная статья: Репликация по типу катящегося кольца


Модель, иллюстрирующая репликацию по типу катящегося кольца
Многие мелкие плазмиды (менее 10 тыс. пар оснований) бактерий и архей, а также некоторые бактериофаги (например, фаг M13 E. coli) используют репликацию по типу катящегося кольца (разматывающегося рулона, σ-типа[8]).
Сущность этого механизма заключается в следующем. Вначале инициаторный белок Rep совершает одноцепочечный разрыв в цепи ДНК. Появившаяся при этом свободная 3'-OH группа служит праймером для синтеза ДНК ДНК-полимеразой III клетки хозяина. В этом процессе задействованы также и другие белки клетки-хозяина, например, ДНК-хеликаза и белок, связывающийся с одноцепочечной ДНК. Так синтезируется лидирующая цепь и восстанавливается двуцепочечная структура исходной ДНК. Содержащая разрыв цепь ДНК при этом удаляется и происходит её репликация ДНК-полимеразой III, сопровождающаяся созданием праймера РНК-полимеразой. После полной репликации ДНК-полимераза I заменяет праймер на ДНК, а ДНК-лигаза сшивает концы, образуя тем самым окончательную двуцепочечную ДНК[7][9].

Плазмиды в клетке[править | править исходный текст]

Передача плазмид[править | править исходный текст]
Плазмида может попасть в клетку несколькими путями. Многие плазмиды могут передаваться при конъюгации бактерий, то есть при их непосредственном контакте; плазмиды также обычно наследуются при обычном делении клеток. Возможна также передача плазмид при трансдукции (то есть вместе с фагом) и при трансформации (плазмида захватывается клеткой извне).
Конъюгативные плазмиды[править | править исходный текст]
Наиболее известной конъюгативной плазмидой является F-плазмида E. coli, свойства которой освещены ниже. Конъюгативные плазмиды известны как у грамположительных, так и у грамотрицательных бактерий.
Функции плазмид[править | править исходный текст]
Многие плазмиды не вызывают заметных изменений в фенотипе своих хозяев. Другие, напротив, ответственны за проявление у клетки-хозяина свойств, помогающих ей выжить в определённых условиях окружающей среды, и без этих плазмид бактерии погибали бы или их рост замедлялся[10].
Функции плазмид в клетке чрезвычайно разнообразны. К ним относят:
перенос генетического материала при конъюгации — F-плазмида;
плазмиды бактериоциногенности контролируют синтез белков, летальных для других бактерий — Col-плазмиды;
синтез гемолизинов — Hly-плазмиды (являются конъюгативными);
устойчивость к тяжёлым металлам;
устойчивость к антибиотикам (R-плазмиды);
синтез энтеротоксинов — Ent-плазмиды;
устойчивость к УФ-излучению;
синтез антигенов, обеспечивающих адгезию бактерий на клетках в организме человека и животных — плазмиды антигенов колонизации;
система рестрикции-модификации;
расщепление камфоры (плазмида САМ), ксилола (плазмида XYL), салицилата (плазмида SAL) (обнаружены у некоторых штаммов Pseudomonas)[11][12].
В следующей таблицы приведены примеры отдельных естественных плазмид и функций, ими выполянемых[10]:

Плазмида Хозяин Размер плазмиды
(тыс. пар оснований) Известная функция
pT181 Staphylococcus aureus 4,4 Устойчивость к тетрациклину
ColEl Escherichia coli 6,6 Образование колицина и
устойчивость к нему
pMBl Escherichia coli 8,5 Система рестрикции-модификации
pGKL2 Kluyveromyces lactisb 13,5 Плазмида-киллер
pAMpi Enterococcus faecalis 26,0 Устойчивость к эритромицину
pSK41 Staphylococcus aureus 46,4 Множественная устойчивость
pBM4000 Bacillus megaterium 53,0 Оперон рРНК
pI258 Staphylococcus aureus 28,0 Устойчивость к ионам тяжёлых металлов
pSLT Salmonella enterica ssp. typhimurium 93,9 Детерминанта вирулентности
pMT1 Yersinia pestis 101,0 Детерминанта вирулентности
pADP-1 Pseudomonas sp. 108,8 Катаболизм атразина (гербицид)
pWW0 Pseudomonas putida 117,0 Деградация ароматических углеводородов
pX01 Bacillus anthracis 181,7 Синтез энтеротоксинов
pSOL1 Clostridium acetobutylicum 192,0 Образование сольвента
pSymB Sinorhizobium meliloti 1683,3 Множественные функции

Передерни на F-фактор, так как он признан наиболее близким к понятию полового фактора бактерий.

F-плазмида[править | править исходный текст]
Основная статья: F-плазмида
Наиболее известной конъюгативной плазмидой является F-плазмида, или F-фактор. F-плазмида является эписомой длиной около 100 тыс. пар оснований. У неё есть собственная точка начала репликации — oriV и точка разрыва — oriT[13]. F-плазмида, как и все конъюгативные плазмиды, кодирует белки, противодействующие прикреплению пилей других бактерий к клеточной стенке данной.
Помимо прочей генетической информации, F-плазмида несёт локусы tra и trb, организованные в один оперон в общей сложности содержащие 34 тыс. пар оснований. Содержащиеся в них гены ответственны за различные аспекты процесса конъюгации: синтез пилина и сборка половых пилей, запуск и регулирование процесса переноса генетического материала, разрыв в локусе oriT и расплетание цепи ДНК[14].
Кроме того, на половых пилях адсорбируются бактериофаги, специфичные к клеткам, содержащим F-плазмиду. К ним относятся РНК-содержащие фаги: R17, MS2, Qβ, f12, а также фаги с одноцепочечной ДНК: fd, f1, M13[15].
R-плазмиды[править | править исходный текст]
Основная статья: R-плазмиды
R-плазмида, или R-фактор, представляет собой кольцевую двуспиральную молекулу ДНК. В ней заключены гены, ответственные за механизм репликации и перенос свойств резистентности в клетку- реципиент (фактор переноса устойчивости, или RTF (от англ. resistance transfer factor)), а также гены, определяющие устойчивость к конкретному антибиотику (обозначаются r (от англ. resistance)[16].
R-фактор передаётся при трансдукции и обычно делении клетки. Некоторые R-плазмиды могут передаваться при конъюгации бактерий, то есть являются конъюгативными. Возможна передача R-плазмид между бактериями различных видов, родов и даже семейств. Так, RP1, плазмида, ответственная за устойчивость к ампициллину, тетрациклину и канамицину у бактерий рода Pseudomonas семейства Pseudomonadaceae может передаваться кишечной палочке E. coli, относящейся к семейству Enterobacteriaceae[17].
Механизм превращения R+-клетками антибиотиков в неактивную форму связан с действием на них специфических ферментов, кодируемых R-плазмидой[16].
С действием R-плазмид часто бывает связан тот факт, что некоторые бактериальные заболевания с трудом поддаются лечению при помощи известных на данный момент антибиотиков.

Col-плазмиды[править | править исходный текст]
Основная статья: Col-плазмиды


Структура колицина А
Col-плазмиды (от англ. colicinogeny — колициногенность) определяют синтез особых белков — колицинов, подавляющий рост и размножение других бактерий, но безвредных для бактерий, их выделяющих.
Этот феномен был открыт в 1925 г. A. Gratia у штамма E. coli. Установлено, что E. coli синтезируют колицины различных типов: A, B, C, D и т.д. Колицины адсорбируются на клетках, лишённых Col-фактора, и, не проникая внутрь, нарушают их метаболизм, вызывая гибель клетки[18].
Классификация[править | править исходный текст]

Существует несколько систем классификации плазмид, базирующихся на:
топологии (линейные или кольцевые),
механизмах репликации (см. выше),
маркерных генах, содержащихся на плазмидах (например: устойчивость к антибиотикам, гены биодеградации ксенобиотиков, системы рестрикции — модификации, гены синтеза бактериоцинов и т. д. — или полному отсутствию оных — криптические плазмиды),
круге хозяев,
копийности,
совместимости,
конъюгативные (способные к переносу в другие клетки)/неконъюгативные.
Вне зависимости от типа, все плазмиды содержат точку инициации репликации (ori V).

Вектор (в генетике) — молекула нуклеиновой кислоты, чаще всего ДНК, используемая в генетической инженерии для передачи генетического материала другой клетке.
Существующие векторы:
плазмиды
фазмиды
векторы на основе вируса SV40
векторы на основе аденовирусов
векторы на основе герпесвирусов
векторы на основе ретровирусов
векторы на основе аденоассоциированного вируса
Пример клонирования ДНК[править | править исходный текст]



Рис. 1. Карта плазмиды pBR 322


Рис. 2. Взаимодействие плазмиды с чужеродной ДНК
В качестве примера рассмотрим процесс клонирования участка чужеродной ДНК бактерией E. coli при помощи плазмиды pBR322[1].
pBR322 — искусственная плазмида, созданная Франциско Боливаром и Раймондом Родригесом с целью клонирования генетического материала. Она представляет собой циклический фрагмент ДНК длиной 4361 нуклеотидных пары (рис. 1). Плазмида содержит ген устойчивости к тетрациклину tet, взятый из естественной плазмиды pSC 101; ген устойчивости к ампициллину amp, взятый из транспозона Tn3; и участок начала репликации ori, заимствованный из плазмиды pMB 1. Тетрациклин и ампициллин — сильные антибиотики. Наличие в плазмиде генов устойчивости к ним (активных или блокированных) играет существенную роль в выделении бактерий со встроенным участком чужеродной ДНК. Плазмида содержит также сайты рестрикции Pst I, Bam HI и Sal I, причём первый находится в гене amp, а два остальных — в гене tet. Это важное обстоятельство помогает модифицировать плазмиду.

Предположим, что в плазмиду необходимо встроить фрагмент, который ранее был вырезан из другой ДНК рестриктазой Bam HI (то есть он имеет на концах последовательность нуклеотидов, характерную для сайта рестрикции Bam HI). Для этого плазмиды обрабатываются рестриктазой Bam HI, (которая разрежет кольцевую молекулу в сайте рестрикции и образует линейный участок ДНК) и добавляются участки чужеродной ДНК. Поскольку на концах всех фрагментов ДНК находятся комплементарные последовательности нуклеотидов, они начнут «склеиваться», причём возможны два варианта склейки (рис. 2) :
Соединятся концы линейной плазмиды pBR 322, образовав исходную (восстановленную) кольцевую плазмиду.
Между концами линейной плазмиды pBR 322 вклинится участок чужеродной ДНК, образовав кольцевую плазмиду со встроенным фрагментом.
Поскольку плазмиды со встроенным фрагментом являются целью процесса, необходимо выделить такие плазмиды и клонировать их. Процесс идёт следующим образом:
Плазмиды внедряются в клетки E. coli. Для этого клетки обрабатываются ионами Ca2+, что делает их мембраны проницаемыми для ДНК.
Полученные бактерии высевают на среду, содержащую ампициллин. В этой среде нормально растут колонии бактерий, содержащие плазмиды, остальные колонии угнетаются. По этому признаку можно отличить бактерии, содержащие плазмиды;
Колонии, содержащие плазмиды, перепечатываются на среду, содержащую тетрациклин. Поскольку чужеродная ДНК вклинивается внутрь гена tet, дезактивируя его, колонии бактерий с модифицированными плазмидами угнетаются тетрациклином. Таким образом они визуально отличимы от колоний бактерий с восстановленными плазмидами.
В результате этих действий выделяются колонии E. coli, в плазмиды которых встроен участок чужеродной ДНК. Они высеваются в обычную среду для дальнейшего клонирования.
Процедуру клонирования можно также вести с помощью рестриктаз Sal I и Pst I. В первом случае процесс будет аналогичен, в последнем бактерии с модифицированными плазмидами будут, наоброт, чувствительны к ампициллину и нечувствительны к тетрациклину.

История изучения[править | править исходный текст]

РНК-полимераза была открыта независимо Сэмом Вайссом и Джерардом Хурвицем в 1960.[1] К этому моменту Нобелевская премия по медицине в 1959 году уже была присуждена Северо Охоа и Артуру Корнбергу за открытие вещества, которое считали РНК-полимеразой[2], впоследствии оказавшегося рибонуклеазой.
Нобелевская премия по химии в 2006 году была присуждена Роджеру Корнбергу за получение точных изображений молекул РНК-полимеразы в различные моменты процесса транскрипции.[3]
Управление транскрипцией[править | править исходный текст]



Электронная микрофотография нитей ДНК, обвешанных сотнями молекул РНК-полимеразы, слишком маленьких для такого разрешения. Каждая РНК-полимераза транскрибирует нить РНК, которая видна на фотографии как ответвление от ДНК. Отметкой «Begin» указан 5'-конец ДНК, с которого РНК-полимераза начинает транскрипцию; «End» — 3'-конец, у которого транскрипция более длинных молекул РНК завершается.
Управление процессом транскрипции генов позволяет контролировать экспрессию генов и таким образом позволяет клетке адаптироваться к изменяющимся условиям внешней среды, поддерживать метаболические процессы на должном уровне, а также выполнять специфические функции, необходимые для существования организма. Неудивительно, что действие РНК-полимеразы очень сложно и зависит от множества факторов (так, у Escherichia coli идентифицировано более 100 факторов, тем или иным способом влияющих на РНК-полимеразу[4]).
РНК-полимераза начинает транскрипцию с особых участков ДНК, называемых промоторами и производит цепочку РНК, комплементарную соответствующей части нити ДНК.
Процесс наращивания молекулы РНК нуклеотидами называется элонгацией. В эукариотических клетках РНК-полимераза может собирать цепочки из более 2,4 млн элементов (например, такую длину имеет полный ген белка дистрофина).
РНК-полимераза завершает формирование цепочки РНК, когда встречает в ДНК специфическую последовательность, называемую терминатором.
РНК-полимераза производит следующие разновидности РНК:

Матричная РНК (мРНК) — шаблон для синтеза белков в рибосомах.
Некодирующая РНК или «РНК-ген» — большой класс генов, кодирующих РНК, на которых не может быть построено белка. Самые известные представители этого класса — транспортная РНК (тРНК) и рибосомная РНК (рРНК), сами участвующие в процессе синтеза белка. Однако начиная с поздних 90-х годов XX столетия было обнаружено много других РНК-генов. Это дало возможность предположить, что РНК-гены играют более значительную роль в клетке, чем было принято считать раньше.
Транспортная РНК (тРНК), переносящая аминокислоты к растущей на рибосоме белковой цепочке во время процесса трансляции.
Рибосомная РНК (рРНК), входящая в состав рибосомы;
МикроРНК, регулирующая активность генов;
Каталитическая РНК, обладающая свойствами ферментов.
РНК-полимераза осуществляет синтез с нуля. Это возможно вследствие того, что взаимодействие начального нуклеотида гена и РНК-полимеразы позволяет ей закрепиться на цепочке и обрабатывать следующие нуклеотиды. Это отчасти объясняет, почему РНК-полимераза обычно начинает транксрипцию с АТФ, за которым следует ГТФ, УТФ и затем ЦТФ. В отличие от ДНК-полимеразы РНК-полимераза обладает также геликазным действием.
Действие РНК-полимеразы[править | править исходный текст]

Связывание и инициирование транскрипции[править | править исходный текст]


Схема инициализации транскрипции
В связывании РНК-полимеразы участвует α-субъединица, распознающая элемент ДНК, предшествующий гену (-40…-70 шагов), и σ-фактор, распознающий участок −10…-35. Существует большое количество σ-факторов, контролирующих экспрессию генов. Например: σ70, который синтезируется в нормальных условиях и позволяет РНК-полимеразе связываться с генами, отвечающими за метаболические процессы клетки; или σ32, блокирующий связывание РНК-полимеразы с генами белков теплового шока.
После связывания с ДНК структура РНК-полимеразы превращается из закрытой в открытую. Это превращение включает в себя разделение моноспиралей ДНК с образованием раскрученного участка длиной около 13 шагов. Рибонуклеотиды затем собираются в цепочку в соответствии с базовой нитью ДНК, используемой в качестве шаблона. Суперскрученность молекул ДНК играет существенную роль в деятельности РНК-полимеразы: поскольку участок ДНК перед РНК-полимеразой раскручен, в нем существуют положительные компенсационные супервитки. Участки ДНК позади РНК-полимеразы снова закручиваются и в них присутствуют отрицательные супервитки.

Элонгация[править | править исходный текст]
Во время элонгационной фазы транскрипции происходит добавление рибонуклеотидов к цепи и переход от структуры РНК-полимеразного комплекса от открытой к транскрипционной. По мере сборки молекулы РНК участок ДНК перед РНК-полимеразой раскручивается далее, и 13-парный открытый комплекс превращается в 17-парный транскрипционный комплекс. В этот момент промотор (участок ДНК −10…-35 шагов) завершается, и σ-фактор отделяется от РНК-полимеразы. Это позволяет остальному РНК-полимеразному комплексу начать движение вперед, так как σ-фактор удерживал его на месте.
17-парный транскрипционный комплекс содержит гибрид ДНК и РНК, содержащий 8 пар оснований — 8-шаговый участок РНК, соединенный с шаблонной цепью ДНК. По мере выполнения транскрипции рибонуклеотиды добавляются к 3'-концу собираемой РНК, и РНК-полимеразный комплекс движется по цепи ДНК. Хотя в РНК-полимеразе не обнаружено свойств, характерных для 3'-экзонуклеазы, аналогичных проверочной деятельности ДНК-полимеразы, есть свидетельства того, что РНК-полимераза останавливается и корректирует ошибки в случаях ошибочного формирования пар оснований ДНК-РНК.
Добавление рибонуклеотидов к РНК обладает механизмом, очень близким к полимеризации ДНК. Считается, что ДНК- и РНК-полимеразы могут быть эволюционно связаны. Аспарагиновые остатки в РНК-полимеразе связываются с ионами Mg2+, которые, в свою очередь, осуществляют выравнивание фосфатных групп рибонуклеотидов: первый Mg2+ удерживает α-фосфат нуклеотидтрифосфата, подлежащего добавлению в цепочку. Это позволяет осуществить связывание нуклеотида с 3' OH-группой конца собираемой цепочки и таким образом добавить НТФ в цепочку. Второй Mg2+ удерживает пирофосфат НТФ. Общее уравнение реакции таким образом имеет вид:
(НМФ)n + НТФ --> (НМФ)n+1 + ПФi
Терминация[править | править исходный текст]
Терминация транскрипции РНК может быть ρ-независимой либо ρ-зависимой.
ρ-независимая терминация осуществляется без помощи ρ-фактора. Транскрипция палиндромного участка ДНК приводит к формированию шпильки из РНК, зацикленной и связанной с самой собой. Эта шпилька богата гуанином и цитозином, что делает ее более стабильной, нежели гибрид ДНК-РНК. В результате 8-парный гибрид ДНК-РНК в транскрипционном комплексе сокращается до 4-парного. В случае если эти 4 последние пары оснований составлены слабыми аденином и уридином, молекула РНК отделяется.[5]

Бактериальная РНК-полимераза[править | править исходный текст]

У бактерий один и тот же фермент катализирует синтез трёх типов РНК: мРНК, рРНК и тРНК.
РНК-полимераза — достаточно большая молекула. Основной фермент содержит 5 субъединиц (~400 кДа):
α2: две α-субъединицы связывают остальные элементы фермента и распознают регулирующие факторы. Каждая субъединица состоит из двух доменов: αСКД (С-концевой домен) связывает первый элемент промотора, и αNКД (N-концевой домен) связывается с остальными компонентами полимеразы.
β: эта субъединица обладает собственно полимеразным действием, катализируя синтез РНК. Она осуществляет инициацию процесса и управляет элонгацией.
β': неспецифически связывается с ДНК.
ω: восстанавливает денатурированную РНК-полимеразу обратно в дееспособную форму in vitro. Также обнаружено ее защитное/шаперонное действие на β'-субъединицу у Mycobacterium smegmatis.
Для связывания с промоторными областями ДНК, основной фермент нуждается в еще одной субъединице — сигма (σ). Сигма-фактор значительно снижает сродство РНК-полимеразы к неспецифичным областям ДНК, и в то же время повышает ее чувствительность к определенным промоторам, в зависимости от своей структуры. С его помощью транскрипция начинается с нужного участка ДНК.
Полный голоэнзим таким образом состоит из 6 субъединиц: α2ββ'σω (~480 кДа). В структуре РНК-полимеразы присутствует канавка длиной 55 Å (5,5 нм) и шириной 25 Å (2,5 нм). Именно в эту канавку помещается двойная спираль ДНК, имеющая ширину 20 Å (2 нм). На длине канавки укладывается 16 нуклеотидов.
Молекулы РНК-полимеразы не растворены в цитоплазме. Когда РНК-полимераза не используется, она связывается с неспецифичными областями ДНК в ожидании открытия активного промотора.
Транскрипционные кофакторы[править | править исходный текст]
Существуют белки, связывающиеся с РНК-полимеразой и влияющие на ее поведение. Например greA и greB из E. coli усиливают способность РНК-полимеразы расщеплять шаблон РНК у растущего конца цепи. Такое расщепление может «спасти» застрявшую молекулу РНК-полимеразы, а также, вероятно, участвует в устранении ошибок сборки цепи РНК.
Отдельный кофактор Mfd задействован в транскрипционном восстановлении ДНК. Во время этого процесса РНК-полимераза обнаруживает поврежденные участки ДНК и привлекает другие ферменты для ее восстановления.
Многие другие кофакторы обладают регулирующим влиянием, заставляя РНК-полимеразу экспрессировать или не экспрессировать определенные гены.

РНК-полимераза в эукариотических клетках[править | править исходный текст]



Главная субъединица РНК-полимераз-I, II и III у человека
Эукариоты обладают различными типами РНК-полимераз, классифицируемыми по типам РНК, которые они производят:
РНК-полимераза I, синтезирующая 45S-предшественника рРНК, превращающуюся затем в рРНК 28S, 18S и 5,8S, которые уже образуют главные РНК-секции рибосомы.[6]
РНК-полимераза II, производящая предшественников для мРНК, а также для большинства мяРНК и миРНК.[7] Это наиболее хорошо изученный тип РНК-полимеразы. Ввиду того, что транскрипция должна происходить под строгим контролем, РНК-полимеразе II для связывания с промоторами требуется целый набор факторов транскрипции.
РНК-полимераза III, синтезирующая тРНК, 5S рРНК и другие малые РНК, присутствующее в ядре и цитозоле.[8]
Существуют также и другие типы РНК-полимеразы, используемые в митохондриях и хлоропластах. Молекулярная масса этих ферментов составляет величину порядка 500 000. Они различаются по чувствительности к альфа-аманитину. РНК-полимераза I нечувствительна к нему, РНК-полимераза III умеренно чувствительна, а РНК-полимераза II сильно ингибируется им.[9]
РНК-полимераза у архей[править | править исходный текст]

Археи используют один вид РНК-полимеразы, который тем не менее очень похож на три основных типа РНК-полимераз у эукариот. Некоторые ученые предполагают, что архейная РНК-полимераза в определенном приближении может являться эволюционным предком специализированных эукариотических полимераз.[10]
РНК-полимераза у вирусов[править | править исходный текст]



РНК-полимераза вируса Т7, производящая мРНК (показана зелёным) из шаблонной ДНК. Белок показан фиолетовой лентой. Изображение взято с PDB 1MSW.
Многие вирусы содержат РНК-полимеразу. Пожалуй, наиболее хорошо изученная вирусная РНК-полимераза имеется у бактериофага Т7. Эта РНК-полимераза, состоящая из одной субъединицы, похожа на митохондриальную и хлоропластную, а также на ДНК-полимеразу.[11] Считается, что большинство вирусных полимераз произошли от ДНК-полимеразы, а не от сложных многокомпонентных РНК-полимераз.
Вирусные полимеразы очень многочисленны. Многие из них могут использовать в качестве шаблона РНК, а не ДНК, как, например, у вирусов с двуцепочечной РНК или с одноцепочечной РНК негативной полярности. Некоторые вирусы с одноцепочечной РНК позитивной полярности также содержат РНК-зависимые РНК-полимеразы.[12]

Функциональные области[править | править исходный текст]

C-концевой домен РНК-полимеразы[править | править исходный текст]
Инициирование транскрипции[править | править исходный текст]
Домен, расположенный на углекислом конце РНК-полимеразы II осуществляет инициирование транскрипции ДНК. C-концевой домен обычно состоит из порядка 52 повторений последовательности Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser [13]. Фактор транскрипции TFIIH, являющийся киназой, гиперфосфорилирует C-концевой домен РНК-полимеразы, тем самым заставляя полимеразный комплекс начать движение от места инициирования транскрипции.
5'-кэпирование[править | править исходный текст]
Основная статья: 5'-кэп
С-концевой домен также является местом связывания комплекса кэпирования. У эукариот после синтеза 5'-конца мРНК фосфатаза концевой фосфат с 5'-конца полирибонуклеотида фермент гуанозинтрансфераза присоединяет к нему гуанозинмонофосфат. При этом образуется 5',5'-трифосфатная связь. Кэпирующий комплекс затем диссоциирует от мРНК, 5'-кэп из ГТФ связывается с кэп-связывающим комплексом, C-концевого домена РНК-полимеразы. 5'-кэп в структуре мРНК эукариот имеет большое значение для связывания молекул мРНК с рибосомами, а также предотвращает деградацию РНК.
Сплайсосома[править | править исходный текст]
Углекисло-концевой домен РНК-полимеразы также является областью связывания со сплайсосомными факторами, участвующими в процессе сплайсинга РНК. Эти факторы способствуют осуществлению сплайсинга и удаление интронов в процессе транскрипции РНК.
Мутация в C-концевом домене[править | править исходный текст]
Был проведен ряд исследований поведения РНК-полимеразы при удалении определенных аминокислот из ее C-концевого домена. Показано, что мутации усечения C-концевого домена РНК-полимеразы II влияют на ее способность начинать транскрипцию набора генов in vivo, снижая чувствительность к активационным последовательностям этих генов.
Очистка РНК-полимеразы[править | править исходный текст]

РНК-полимераза может быть выделена следующими способами:
На фосфоцеллюлозной колонке.[14]
При помощи глицеринового градиентного центрифугирования.[15]
С использованием колонки ДНК.
На ионообменной колонке.[16]
А также комбинациями вышеуказанных методов.

ДНК-полимераза — фермент, участвующий в репликации ДНК. Ферменты этого класса катализируют полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль цепочки нуклеотидов ДНК, которую фермент «читает» и использует в качестве шаблона. Тип нового нуклеотида определяется по принципу комплементарности с шаблоном, с которого ведётся считывание. Собираемая молекула комплементарна шаблонной моноспирали и идентична второму компоненту двойной спирали.
Выделяют ДНК-зависимую ДНК-полимеразу (КФ 2.7.7.7), использующую в качестве матрицы одну из цепей ДНК, и РНК-зависимую ДНК-полимеразу (другое название обратная транскриптаза, КФ 2.7.7.49), способную также к считыванию информации с РНК (обратная транскрипция).
ДНК-полимеразу считают холоферментом, поскольку для нормального функционирования она требует присутствия ионов магния в качестве кофактора. В отсутствие ионов магния о ней можно говорить как об апоферментe.
ДНК-полимераза начинает репликацию ДНК, связываясь с отрезком цепи нуклеотидов. Среднее количество нуклеотидов, присоединяемое ферментов ДНК-полимеразой за один акт связывания/диссоциации с матрицей, называют процессивностью.
Содержание [убрать]
1 Действие ДНК-полимеразы
2 Многообразие ДНК-полимераз
3 Семейства ДНК-полимераз
3.1 Семейство A
3.2 Семейство B
3.3 Семейство C
3.4 Семейство D
3.5 Семейство X
3.6 Семейство Y
3.7 Семейство RT
4 Прокариотические ДНК-полимеразы
5 Эукариотические ДНК-полимеразы
6 См. также
7 Примечания
8 Литература
9 Ссылки

Действие ДНК-полимеразы[править | править исходный текст]



Репликация ДНК
Как известно, две цепи молекулы ДНК антипараллельны. Разные концы одной цепи называются 3’-конец и 5’-конец. Репликация происходит путем непрерывного роста нуклеотида за нуклеотидом обеих новых цепей одновременно. Матрица считывается ДНК-полимеразой только в направлении 3’-5’, добавляя свободные нуклеотиды к 3’-концу собираемой цепочки. Поэтому синтез ДНК происходит непрерывно только на одной из матричных цепей, называемой «лидирующей». Во второй цепи («отстающей») синтез происходит короткими фрагментами.
Ни одна из известных ДНК-полимераз не может создать цепочку «с нуля»: они в состоянии лишь добавлять нуклеотиды к уже существующей 3’-гидроксильной группе. По этой причине ДНК-полимераза нуждается в праймере, к которому она могла бы добавить первый нуклеотид. Праймеры состоят из оснований РНК и ДНК, при этом первые два основания всегда РНК-основания. Праймеры синтезируются другим ферментом — праймазой. Ещё один фермент — геликаза — необходим для раскручивания двойной спирали ДНК с формированием одноцепочечной структуры, которая обеспечивает репликацию обеих цепочек в соответствии с полуконсервативной моделью репликации ДНК.
Некоторые ДНК-полимеразы обладают также способностью исправлять ошибки во вновь собираемой цепочке ДНК. Если происходит обнаружение неправильной пары нуклеотидов, ДНК-полимераза откатывается на один шаг назад. Благодаря своей 3'-5' экзонуклеазной гидролитической активности ДНК-полимераза может исключить неправильный нуклеотид из цепочки и затем вставить на его место правильный, после чего репликация продолжается в нормальном режиме.
Многообразие ДНК-полимераз[править | править исходный текст]

Структура ДНК-полимераз достаточно жёстко фиксирована. Их каталитические субъединицы очень мало различаются в различных видах живых клеток. Такая фиксация структуры обычно появляется там, где отсутствие разнообразия обусловлено огромной важностью или даже незаменимостью для функционирования клетки.
Генами некоторых вирусов тоже кодируются особые ДНК-полимеразы, которые могут избирательно реплицировать вирусные ДНК. Ретровирусы обладают геном необычной ДНК-полимеразы, называемой ещё обратной транскриптазой, являющейся РНК-зависимой ДНК-полимеразой и осуществляющей сборку ДНК на основе шаблонной РНК.

Семейства ДНК-полимераз[править | править исходный текст]

На основании своей структуры ДНК-полимеразы могут быть разбиты на семь различных семейств: A, B, C, D, X, Y, и RT.
Семейство A[править | править исходный текст]
Семейство A включает в себя репликативные и восстановительные ДНК-полимеразы. Репликативные члены этого семейства представлены, например, хорошо исследованной ДНК-полимеразой вируса Т7 или эукариотической митохондриальной ДНК-полимеразой γ. Среди восстановительных полимераз мы находим такие примеры как ДНК-полимераза I E. coli, полимераза I из Thermus aquaticus или полимераза I Bacillus stearothermophilus. Восстановительные полимеразы участвуют в процессе устранения ошибок в собираемой ДНК, а также в обработке фрагментов Оказаки.
Семейство B[править | править исходный текст]
В семейство B в основном входят восстановительные полимеразы, в том числе основные эукариотические ДНК-полимеразы α, δ, и ε, а также ДНК-полимераза ζ. К этому семейству также относят ДНК-полимеразы некоторых бактерий и бактериофагов, например бактериофагов T4, Phi29 and RB69. Эти ферменты используются в синтезе и 3’-5’, и 5’-3’ моноцепей ДНК. Отличительной особенностью полимераз этого семейства является замечательная точность репликации. Многие также обладает сильным 3’-5’-экзонуклеазным действием (за исключением ДНК-полимераз α и ζ, у которых способности корректировать ошибки не наблюдается).
Семейство C[править | править исходный текст]
Полимеразы этого семейства — в основном бактериальные хромосомные репликативные ферменты, обладающие, кроме того, 3’-5’-экзонуклеазным действием.
Семейство D[править | править исходный текст]
Полимеразы этого семейства недостаточно изучены. Все известные образцы считаются репликативными полимеразами и обнаружены у архей субдомена Euryarchaeota.
Семейство X[править | править исходный текст]
К семейству Х относится широко известная эукариотическая ДНК-полимераза β, а также и другие, такие как σ, λ, μ и концевая дезоксинуклеотидил-трансфераза (TdT). ДНК-полимераза β необходима для осуществления процесса восстановления поврежденных участков ДНК. Полимеразы λ и μ участвуют в негомологическом соединении — процессе восстановления разрывов двойной спирали.. TdT экспрессируется только в лимфоидной ткани и добавляет «n нуклеотидов» к разрывам двойной спирали, образующимся во время В(Р)С-рекомбинации. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae обладают лишь одной полимеразой X, Pol4, участвующей в негомологическом соединении.
Семейство Y[править | править исходный текст]
Полимеразы этого семейства отличаются от прочих низкой производительностью на целостных шаблонах, а также способностью осуществлять репликацию на шаблонах поврежденных ДНК. Вследствие этого члены семейства называются полимеразами транслезионного синтеза. В зависимости от характера повреждения (лезии) ТЛС-полимеразы могут восстановить исходную цепочку. Ошибка может и не быть восстановлена, что приводит к мутациям. Страдающие Xeroderma pigmentosum, например, обладают мутантным геном ДНК-полимеразы η (eta), который толерантен к повреждениям, однако другие полимеразы, например ζ (относящаяся к семейству B), страдают от мутаций, что, как считается, приводит к предрасположенности к онкологическим заболеваниям.
Другие члены этого семейства — человеческие полимеразы ι, κ, а также концевая дезоксинуклеотидил-трансфераза Rev1. У E.coli имеются две ТЛС-полимеразы: IV (DINB) и V (UMUC).
Семейство RT[править | править исходный текст]
Основная статья: Обратная транскриптаза
Семейство обратных транскриптаз (название семейства происходит от англ. reverse transcriptase) содержит полимеразы, обнаруженные как у ретровирусов, так и у эукариот. Они являются РНК-зависимыми ДНК-полимеразами, то есть, в отличие от описанных выше ферментов, используют в качестве матрицы для синтеза РНК, а не ДНК. Эукариотические обратные транскриптазы в основном представлены теломеразами. Эти полимеразы используют шаблонную РНК для синтеза цепочки ДНК.

Прокариотические ДНК-полимеразы[править | править исходный текст]

У бактерий обнаружено пять ДНК-полимераз:
ДНК-полимераза I задействована в восстановлении ДНК, обладает и 5'-3', и 3'-5'-экзонуклеазным действием;
ДНК-полимераза II участвует в репликации поврежденной ДНК. Обладает способностью 5'-3'-удлинения цепочки и 3'-5'-экзонуклеазным действием;
ДНК-полимераза III — основная полимераза бактерий, обладающая также 3'-5'-экзонуклеазным действием;
ДНК-полимераза IV, ДНК-полимераза семейства Y;
ДНК-полимераза V, ДНК-полимераза семейства Y, принимающая участие в пропуске поврежденных участков ДНК.
Эукариотические ДНК-полимеразы[править | править исходный текст]

Эукариоты содержат по меньшей мере пятнадцать видов ДНК-полимераз[1]:
ДНК-полимераза α выступает сначала в роли праймазы, синтезируя праймер ДНК, а затем как нормальная полимераза, присоединяя к этому праймеру нуклеотиды. После того, как длина цепочки достигнет около 20 нуклеотидов[2], к транскрипции приступают полимеразы δ и ε;
ДНК-полимераза β задействована в восстановлении ДНК;
Pol γ, осуществляющая репликацию митохондриальной ДНК;
ДНК-полимераза δ — основная полимераза эукариот. Она высокопроизводительна, а также обладает 3'-5'-экзонуклеазным действием;
ДНК-полимераза ε, иногда замещающая ДНК-полимеразу δ во время синтеза 3’-5’-моноспирали. Основное назначение этой полимеразы неясно;
ДНК-полимеразы η, ι, κ, и Rev1 из семейства Y, а также ζ из семейства B. Эти полимеразы задействованы в пропуске поврежденных участков ДНК[3].
Существуют также другие эукариотические ДНК-полимеразы, которые пока недостаточно изучены: θ, λ, φ, σ и μ.
Обнаружены и другие эукариотические полимеразы.
Ни одна эукариотическая полимераза не может отщеплять праймеры, то есть не обладает 5’-3’-экзонуклеазным действием. Эту функцию выполняют другие ферменты. Только полимеразы, осуществляющие элонгацию (γ, δ и ε) обладают 3'-5'-экзонуклеазными свойствами.

Полимера
зная цепна
я реа
кция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).
Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.
Содержание [убрать]
1 История
2 Проведение ПЦР
2.1 Компоненты реакции
2.2 Праймеры
2.3 Амплификатор
3 Ход реакции
3.1 Денатурация
3.2 Отжиг
3.3 Элонгация
4 Разновидности ПЦР
5 Применение ПЦР
5.1 Криминалистика
5.2 Установление отцовства
5.3 Медицинская диагностика
5.4 Персонализированная медицина
5.5 Клонирование генов
5.6 Секвенирование ДНК
5.7 Мутагенез
6 См. также
7 Примечания
8 Литература
9 Ссылки

История[править | править исходный текст]

В начале 1970-х годов норвежский учёный Хьелль Клеппе из лаборатории нобелевского лауреата Хара Гобинды Хораны предложил способ амплификации ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК — синтетических праймеров[1]. Однако в то время эта идея осталась нереализованной. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была изобретена в 1983 году американским биохимиком Кэри Муллисом. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Первая публикация по методу ПЦР появилась в ноябре 1985 года в журнале Science[2]. Через 8 лет после этого за изобретение метода ПЦР Кэри Муллис получил Нобелевскую премию[3].
В начале использования метода после каждого цикла нагревания-охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, так как она инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура проведения реакции была сравнительно неэффективной, требовала много времени и фермента. В 1986 году метод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий[4]. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq-полимеразой. Недостаток этой полимеразы заключается в том, что вероятность внесения ошибочного нуклеотида у неё достаточно высока, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления ошибок (3'→5' экзонуклеазная активность). Полимеразы Pfu и Pwo, выделенные из архей, обладают таким механизмом, их использование значительно уменьшает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем у Taq. Сейчас применяют смеси Taq и Pfu, чтобы добиться одновременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования.
В момент изобретения метода Кэри Муллис работал химиком-синтетиком (он синтезировал олигонуклеотиды, которые применялись тогда для выявления точечных мутаций методом гибридизации с геномной ДНК) в компании Цетус (Cetus Corporation), которая и запатентовала метод ПЦР. В 1992 году Цетус продала права на метод и патент на использование Taq-полимеразы компании Хофман-Ла Рош за 300 млн долларов. Однако оказалось, что Taq-полимераза была охарактеризована советскими биохимиками А. Калединым, А. Слюсаренко и С.Городецким в 1980 году[5], а также за 4 года до этой советской публикации, то есть в 1976 году, американскими биохимиками Alice Chien, David B.Edgar и John M. Trela.[6] В связи с этим компания Промега (Promega) пыталась в судебном порядке заставить Рош отказаться от исключительных прав на этот фермент[7]. Американский патент на метод ПЦР истёк в марте 2005 г.

Проведение ПЦР[править | править исходный текст]

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка нуклеиновой кислоты ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp[8]). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20—40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований[9].
Компоненты реакции[править | править исходный текст]
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.
Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.
Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.
Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию[10].

Праймеры[править | править исходный текст]
Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18—30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка.
После гибридизации матрицы с праймером (отжиг[11]), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы (см. ниже).
Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления (Tm) комплекса праймер-матрица.
Tm — температура, при которой половина ДНК-матриц образует комплекс с олигонуклеотидным праймером. Усредненная формула подсчета Tm для короткого олигонуклеотида (и для длинных ДНК фрагментов), с учетом концентрации ионов K+ и DMSO:
T_m = 77.1+11.7\lg[K^+]+\frac{41(G+C)- 528}{L}-0.75[%DMSO],[12]
где L — количество нуклеотидов в праймере, K+ — молярная концентрация ионов калия, G+C — сумма всех гуанинов и цитозинов.
В случае неверного выбора длины и нуклеотидного состава праймера или температуры отжига возможно образование частично комплементарных комплексов с другими участками матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Верхний предел температуры плавления ограничен оптимумом температуры действия полимеразы, активность которой падает при температурах выше 80 °C.
При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев:
GC-состав ~ 40—60 %;
близкие Tm праймеров (отличия не более, чем на 5 °C);
отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек[13] и димеров[14];
желательно, чтобы на 3’-конце был гуанин или цитозин, поскольку они образуют три водородные связи с молекулой матрицы, делая гибридизацию более стабильной.
Амплификатор[править | править исходный текст]


Рис. 1: Амплификатор для проведения ПЦР
ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР (см. ниже) и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C. Для ПЦР в реальном времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.

Ход реакции[править | править исходный текст]



Фотография геля, содержащего маркерную ДНК (первый и последний слоты) и продукты ПЦР
Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий (рис. 2).
Денатурация[править | править исходный текст]
Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Обычно, перед первым циклом проводят длительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин для полной денатурации матрицы и праймеров.
Отжиг[править | править исходный текст]
Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается равной температуре плавления праймеров. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре). Время стадии отжига — 30 сек, одновременно, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов. Поэтому рекомендуется подбирать праймеры с температурой плавления выше 60 °C и проводить отжиг и элонгацию одновременно, при 60-72 °C.
Элонгация[править | править исходный текст]
ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5' к 3' концу. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 мин.

Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2n — 2n, где n — число циклов реакции[15]. На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100 %, поэтому в действительности P ~ (1+E)n, где P — количество продукта, Е — средняя эффективность цикла.
Число «длинных» копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент.
Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато».
Разновидности ПЦР[править | править исходный текст]

Вложенная ПЦР (Nested PCR (англ.)) — применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.
Инвертированная ПЦР (Inverse PCR (англ.)) — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов (лигирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.
ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR (англ.)) — используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы и получают одноцепочечную кДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены.
Асимметричная ПЦР (англ. Asymmetric PCR) — проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке. Модификаций этого метода является англ. Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR), в котором используются праймеры с разной концентрацией, и праймер с низкой концентрацией подбирается с высокой (температурой плавления), чем праймер с высокой концентрацией. ПЦР проводят при высокой температуре отжига, тем самым удаётся поддержать эффективности реакции на протяжении всех циклов[16].
Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR (англ.)) или ПЦР в реальном времени — используется для непосредственного наблюдения за измерением количества конкретного ПЦР продукта в каждом цикле реакции. В этом методе используют флуоресцентно-меченые праймеры или ДНК-зонды для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления; или используется флуоресцентный интеркалирующий краситель Sybr Green I (но лучше использовать SYTO 13), который связывается с двухцепочечной ДНК. Sybr Green I обеспечивает простой и экономичный вариант для детекции и количественного определения ПЦР-продуктов в ходе ПЦР в режиме реального времени без необходимости использования специфичных флуоресцентных зондов или праймеров. В ходе амплификации краситель SYBR Green I встраивается в малую бороздку ДНК ПЦР продуктов и испускает более сильный по сравнению с несвязанным красителем флуоресцентный сигнал при облучении синим лазером. SYBR Green I совместим со всеми известными на сегодняшний день приборами для проведения ПЦР в режиме реального времени. Максимум поглощения для SYBR Green I находится при длине волны 494 нм. Кроме главного, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения — при 290 нм и 380 нм. Максимум испускания для SYBR Green I находится при длине волны 521 нм (зелёный)[17].
Ступенчатая ПЦР (Touchdown PCR (англ.)) — с помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров. Первые циклы проводят при температуре выше оптимальной температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру отжига постепенно снижают до оптимальной. Это делается для того, чтобы праймер гибридизовался с комплементарной цепью всей своей длиной; тогда как при оптимальной температуре отжига, праймер частично гибридизуется с комплементарной цепью. Частичная гибридизация праймера на геномной ДНК приводит к неспецифической амплификации, если участков связывания для праймера достаточно много. В большинстве случаев, первые десять ПЦР циклов, можно проводить при температуре отжига в 72-75°С, а затем сразу снизить до оптимальной, например до 60-65°С.
Метод молекулярных колоний (ПЦР в геле, англ. Colony - PCR Colony) — акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.
ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (англ. Rapid amplification

ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) — модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч и более оснований). Используют смесь двух полимераз, одна из которых — Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК полимераза с 3'-5' экзонуклеазной активностью, обычно это Pfu полимераза. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесённые первой, так как Taq-полимераза останавливает синтез ДНК если был добавлен не комплементарный нуклеотид. Этот не комплементарный нуклеотид удаляет Pfu полимераза. Смесь полимераз берется в отношении 50:1 или даже меньше 100:1, где Taq-полимеразы берётся в 25—100 раз больше по отношению к Pfu-полимеразе.
RAPD (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA), ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК — используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (около 10 п.н.). Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удаётся добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов.
Групп-специфическая ПЦР (англ. group-specific PCR) — ПЦР для родственных последовательностях внутри одного или между разными видами, используя консервативные праймеры к этим последовательностям. Например, подбор универсальных праймеров к рибосомальным 18S и 26S генам для амплификации видоспецифического межгенного спейсера: последовательность генов 18S и 26S консервативна между видами, поэтому ПЦР между этими генами будет проходить для всех исследуемых видов. Противоположный этому методу является — уникальная ПЦР (англ. unique PCR), в котором задача состоит в подборе праймеров для амплификации только конкретной последовательности среди родственных последовательностей.
ПЦР с использованием горячего старта (англ. Hot-start PCR) — модификация ПЦР с использованием ДНК-полимеразы, в которой полимеразная активность блокируется при комнатной температуре антителами или имитирующие антитела небольшими молекулами типа Affibody, то есть в момент постановки реакции до первой денатурации в ПЦР. Обычно первая денатурация проводится при 95 °C в течение 10 минут.
Виртуальная ПЦР (англ. in silico PCR, цифровая ПЦР, электронная ПЦР, е-ПЦР) — математический метод компьютерного анализа теоретической полимеразной цепной реакции c использованием списка последовательностей праймеров (или ДНК-зондов) для предсказания потенциальной амплификации ДНК исследуемого генома, хромосомы, кольцевой ДНК или любого другого участка ДНК.
Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые основания. Например, последовательность праймера может быть такой: …ATH…, где Н — А, Т или С.

Применение ПЦР[править | править исходный текст]

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах.
Криминалистика[править | править исходный текст]
ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически — одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью электрофореза ДНК. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев (англ. genetic fingerprint).
Установление отцовства[править | править исходный текст]


Рис. 3: Результаты электрофореза ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР. (1) Отец. (2) Ребёнок. (3) Мать. Ребёнок унаследовал некоторые особенности генетического отпечатка обоих родителей, что дало новый, уникальный отпечаток.
Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны (за исключением случая однояйцевых близнецов), родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков (рис. 3). Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов.
Медицинская диагностика[править | править исходный текст]
ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания.
Персонализированная медицина[править | править исходный текст]
Иногда лекарства оказываются токсичными или аллергенными для некоторых пациентов. Причины этого — отчасти в индивидуальных различиях в восприимчивости и метаболизме лекарств и их производных. Эти различия детерминируются на генетическом уровне. Например, у одного пациента определенный цитохром (белок печени, отвечающий за метаболизм чужеродных веществ) может быть более активен, у другого — менее. Для того, чтобы определить, какой разновидностью цитохрома обладает данный пациент, предложено проводить ПЦР-анализ перед применением лекарства.[источник не указан 1574 дня] Такой анализ называют предварительным генотипированием (англ. prospective genotyping).
Клонирование генов[править | править исходный текст]
Клонирование генов (не путать с клонированием организмов) — это процесс выделения генов и, в результате генноинженерных манипуляций, получения большого количества продукта данного гена. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор — фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. В качестве векторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена — РНК или, чаще всего, белка. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве, медицине и др.

Секвенирование ДНК[править | править исходный текст]
Основная статья: Секвенирование
В методе секвенирования с использованием меченных флуоресцентной меткой или радиоактивным изотопом дидезоксинуклеотидов ПЦР является неотъемлемой частью, так как именно в ходе полимеризации в цепь ДНК встраиваются производные нуклеотидов, меченные флуоресцентной или радиоактивной меткой. Присоединение дидезоксинуклеотида к синтезируемой цепи приводит к обрыву синтеза, позволяя определить положение специфических нуклеотидов после разделения в геле.
Мутагенез[править | править исходный текст]
Основная статья: Мутагенез
В настоящее время ПЦР стала основным методом проведения мутагенеза (внесения изменений в нуклеотидную последовательность ДНК). Использование ПЦР позволило упростить и ускорить процедуру проведения мутагенеза, а также сделать её более надёжной и воспроизводимой.
См. также[править | править исходный текст]

ДНК
Использование ДНК в технологии
Электрофорез
ДНК электрофорез
Секвенирование
Секвенирование РНК
Real-time PCR
Методы секвенирования нового поколения
en: Nicking enzyme amplification reaction (NEAR)[18]

Электрофорез (от электро- и др.-греч. φορ�ω — «переношу») — это электрокинетическое явление перемещения частиц дисперсной фазы (коллоидных или белковых растворов) в жидкой или газообразной среде под действием внешнего электрического поля. Впервые было открыто профессорами Московского университета П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году.
С помощью электрофореза удаётся покрывать мелкими частицами поверхность, обеспечивая глубокое проникновение в углубления и поры. Различают две разновидности электрофореза: катафорез — когда обрабатываемая поверхность имеет отрицательный электрический заряд (то есть подключена к отрицательному контакту источника тока, являясь катодом) и анафорез — когда заряд поверхности положительный.
Электрофорез применяют в физиотерапии, для окраски автомобилей, в химической промышленности, для осаждения дымов и туманов, для изучения состава растворов и др. Электрофорез является одним из наиболее важных методов для разделения и анализа компонентов веществ в химии, биохимии и молекулярной биологии.
Содержание [убрать]
1 Электрофорез в медицине (физиотерапии)
2 Электрофорез в научных исследованиях
3 Гальванофорез
4 Примечания
5 См. также

Электрофорез в медицине (физиотерапии)[править | править исходный текст]

Основная статья: Ионофорез
Лечебное вещество наносится на прокладки электродов и под действием электрического поля проникает в организм через кожные покровы (в терапии, неврологии, травматологии и др.) или слизистые оболочки (в стоматологии, ЛОР, гинекологии и др.) и влияет на физиологические и патологические процессы непосредственно в месте введения. Электрический ток также оказывает нервно-рефлекторное и гуморальное действие.
Преимущества лечебного электрофореза:
введение малых, но достаточно эффективных доз действующего вещества;
накопление вещества и создание депо, пролонгированность действия;
введение в наиболее химически активной форме — в виде ионов;
возможность создания высокой местной концентрации действующего вещества без насыщения им лимфы, крови и других сред организма;
возможность введения вещества непосредственно в очаги воспаления, блокированные в результате нарушения локальной микроциркуляции;
лечебное вещество не разрушается, как например, при введении per os;
слабый электрический ток благоприятно влияет на реактивность и иммунобиологический статус тканей.
Противопоказания к проведению электрофореза: острые гнойные воспалительные заболевания, СН II—III степени, ГБ III стадии, лихорадка, тяжелая форма бронхиальной астмы, дерматит или нарушение целостности кожи в местах наложения электродов, злокачественные новообразования. Учитываются противопоказания для лечебного вещества. Вещества, используемые при электрофорезе, по способу введения разделяются на:
отрицательно заряженные, вводимые с отрицательного полюса — катода (бромиды, йодиды, никотиновая кислота и другие);
положительно заряженные, вводимые с положительного полюса — анода (ионы металлов — магний, калия, кальция);
вводимые как с анода, так и с катода (гумизоль, бишофит и другие).
Преимущество бишофита — в биполярном введении, так как эффект оказывают одновременно и положительно, и отрицательно заряженные ионы. При назначении семейным врачом лечебного электрофореза при направлении в отделение медицинской реабилитации целесообразно указывать: диагноз, название метода (электрофорез), желаемое лечебное вещество и зоны его воздействия. Физиотерапевт определяет полярность, силу тока, продолжительность в минутах, кратность процедур.

Электрофорез в научных исследованиях[править | править исходный текст]

В биохимии и молекулярной биологии электрофорез используется для разделения макромолекул — белков и нуклеиновых кислот (а также их фрагментов). Различают множество разновидностей этого метода (см. статью Электрофорез белков). Этот метод находит широчайшее применение для разделения смесей биомолекул на фракции или индивидуальные вещества и используется в биохимии, молекулярной биологии, клинической диагностике, популяционной биологии (для изучения генетической изменчивости) и др.
Гальванофорез[править | править исходный текст]

Гальванофорез — введение ионов веществ (например: лекарств) в электропроводную среду посредством приложения электродвижущей силы (ЭДС). В стоматологии — гальванофорез — специальный метод для долговременной дезинфекции системы корневых каналов зубов.
Отличие от электрофореза — для создания ЭДС применяются не стационарные источники тока, а мобильные устройства малых размеров. Такие устройства могут быть например установлены в зуб пациенту на несколько дней или недель. В течение продолжительного периода гальванический элемент обеспечивает прохождение слабого электрического тока (в несколько микроампер) через ткани, в которые намечена доставка определенных веществ.
Электрофорез — процедура, которую проводят в медицинском кабинете. При гальванофорезе пациент находится вне лечебного учреждения. Слабые токи не представляют никакой опасности и не имеют осложнений и противопоказаний. Длительность воздействия токами при гальванофорезе позволяет получать другое качество лечения.
Гальванофорез осуществляется при помощи специальных устройств, устанавливаемых в корневые каналы зубов. Устройства могут быть выполнены в виде штифта, либо другой конструкции из металлов, составляющих гальванопару.
Устройства для гальванофореза создают ЭДС в среде корневых каналов, которая предварительно доводится до нужных значений концентрации определенных ионов путем введения в корневые каналы специальных препаратов (например, гидроксид меди-кальция). Под воздействием электрических полей, создаваемых гальваническими штифтами (устройствами для гальванофореза) Гидроокись меди-кальция (ГМК) мигрирует в микроканалы и дентинные трубочки. Вызывает протеолиз находящихся там микробных тел и остатков клеточных структур больного зуба. ГМК присоединяет к иону меди серу, отнимая ее у аминокислот белков, находящихся в структурах тканей зубов.
В отличие от распространенного метода депофореза, гальванофорез не требует применения дорогостоящих приборов, не вызывает боли в процессе его применения и создает в тканях зубов антимикробную среду на длительное время.

Электрофорез ДНК — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине) и форме (в случае, если ДНК образует вторичные структуры, например шпильки). Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее.
К образцам обычно добавляют низкомолекулярный кислый краситель (например, динитрофенол, бромфеноловый синий), чтобы визуализировать ход электрофореза в процессе. Краситель также необходим для того, чтобы определить, когда стоит остановить процесс.
Электрофорез проводится в камере, заполненной буферным раствором. Чаще всего используются буферы, содержащие ЭДТА, трис и борную кислоту: TAE и TBE. Буфер необходим для повышения ионной силы раствора, в котором будет происходить разделение молекул ДНК под действием приложенного электрического поля.
После разделения (иногда краситель вносят в расплавленную агарозу) фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ-лучах.
Определение размеров производят путем сравнения коммерчески доступных фрагментов ДНК (DNA ladder, «линейка»), содержащий линейные фрагменты ДНК известной длины.
Для электрофоретического анализа ДНК обычно используют агарозные (для относительно длинных молекул ДНК) и полиакриламидные (для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, в случае секвенирования) гели.

Полиакриламид (сокр. ПАА) — общее название группы полимеров и сополимеров на основе акриламида и его производных.


Элементарное звено макромолекулы полиакриламида
По правилам ИЮПАК основное название — поли(2-пропенамид) или поли(1-карбамоилэтилен), общая формула — (-CH2CHCONH2-)n.
Содержание [убрать]
1 Получение и химические свойства
1.1 Синтез
2 Гомогенная полимеризация
2.1 Промышленное производство
3 Применение
4 Ссылки
Получение и химические свойства[править | править исходный текст]

Синтез[править | править исходный текст]
Основным методом синтеза полимеров на основе акриламида (АА) и других ненасыщенных амидов является радикальная полимеризация, которую можно проводить всеми известными способами: в массе кристаллических и расплавленных мономеров, в растворе, эмульсии и суспензии. Каждый из способов имеет свои особенности, обусловливающие свойства полимеров и технико-экономические показатели производства. Ниже рассмотрены закономерности и технологические аспекты гомополимеризации АА и других ненасыщенных амидов при различных способах синтеза. Кроме того, в эту главу включены разделы, касающиеся специфики полимеризации АА с другими мономерами и прививки АА к различным полимерам.

>>63426664
>Засрал
Ой, нахуй иди, жируха. Читай, хоть поумнеешь, а то только представляешь, как гомогеи друг другу хуи обсасывают.

Гомогенная полимеризация[править | править исходный текст]

К гомогенной полимеризации относятся процессы полимеризации в растворителях, в которых растворимы и мономер, и полимер. Для полиакриамида (ПАА) число таких растворителей невелико: вода, формамид, уксусная и муравьиная кислоты, диметилсульфоксид (ДМСО), а также некоторые водно-органические смеси. Кроме того, ПАА ограниченно растворяется в диметилформамиде (ДМФА), этиленгликоле и глицерине. Полиметакриламид (ПМАА) значительно хуже растворим, чем ПАА. Полимеры N,N-диметил- и N,N-диэтилакриламида растворимы в воде и нерастворимы в углеводородах. Поли-N,N-диэтилакрил-амид растворим в ацетоне. Полимеры с более длинным алкильным заместителем у атома азота хуже растворяются в воде, но более растворимы в органических растворителях. Поли-N-метил- и поли-N-н-бу-тилметакриламид хорошо растворяются в ДМФА, полимер N-(2-этил-гексил)-метакриламида- в толуоле. Полимеры акрил- и метакрилмо-чевин растворимы в концентрированных растворах хлороводородной кислоты.
N-Замещенные акриламиды, как правило, полимеризуются значительно быстрее соответствующих метакриламидных производных. Акриламиды с объемными, например антрахиноновыми, заместителями не вступают в гомополимеризацию.
Среди способов синтеза полимеров на основе АА важное место занимает полимеризация в водных растворах. Основными факторами, определяющими распространенность этого способа полимеризации, являются высокие скорости образования полимера и возможность получения в этих условиях полимера с высокой молекулярной массой. Предполагается, что причиной специфического влияния воды на полимеризацию АА является протонирование радикала, приводящее к локализации неспаренного электрона, в результате чего повышается реакционная способность макрорадикала, выражающаяся в высоких значениях константы скорости роста цепи. Взаимное отталкивание одноименно заряженных радикалов ответственно за ограничение константы скорости бимолекулярного обрыва цепи. В непротонированном радикале, существующем при полимеризации в неводных растворителях, сопряжение неспаренного электрона с -электронами группы С=О приводит к стабилизации радикала и уменьшению его активности. Кроме того, высокая реакционная способность АА в водных растворах может быть связана с подавлением автоассоциации молекул этого мономера ввиду образования ими водородных связей с молекулами воды. В неполярных же растворителях, неспособных образовывать такие связи с АА, мономер находится преимущественно в ассоциированном состоянии в виде циклических димера, тримера и линейных многомолекулярных ассоциатов. С этим предположением согласуются и данные, полученные при полимеризации N-замещенных акрил- и метакриламидов. Так, N-o-метокси- и N-o-этоксифенилметакриламиды полимеризуются в массе значительно быстрее, чем их м- и n-изомеры, поскольку у первых ассоциация молекул отсутствует, а молекулы вторых ассоциированы посредством водородных связей. В свою очередь, диметил-гидразиды акриловая кислота (АК) и метакриловая кислота (МАК), в отличие от их гидрохлоридов, не полимеризуются в массе, поскольку молекулы этих мономеров сильно ассоциированы. В водных же растворах в полимеры превращаются как соли, так и свободные основания.
В связи с вышеизложенным АА имеет довольно высокое значение соотношения констант kp/k00,5 (по данным разных авторов для интервала температур 30-60 °C оно составляет 3,2-4,4), что наряду с малыми величинами констант передачи цепи на мономер и воду обусловливает возможность получения в водных растворах ПАА со скоростью и молекулярной массой (ММ), недостижимыми при полимеризации в органических растворителях. К другим причинам широкого распространения полимеризации в воде следует отнести сокращение энергетических затрат на выделение исходного мономера в кристаллическом виде, которое к тому же связано с вероятностью его спонтанной полимеризации, и на регенерацию органических растворителей, снижение загрязнения окружающей среды, а также исключение стадии растворения полимерных реагентов, использующихся, как правило, в виде водных растворов.

Промышленное производство[править | править исходный текст]
Широкое производство полиакриламида началось в начале 1950-х годов. Устойчивый рост был обеспечен уникальными свойствами полиэлектролита, обеспечившими ему возможность широкого применения в качестве гелеобразователя, плёнкообразователя, флокулянта и коагулянта.
Применение[править | править исходный текст]

Основное применение полиакриламид находит в качестве недорогого водорастворимого полимера со свойствами полиэлектролита. Ниже приведены основные сферы применения ПАА:
Очистка воды. ПАА — хороший и недорогой коагулянт и флокулянт для очистки питьевой воды, технологических сточных вод.
Получение гелей для химического анализа сложных биологических систем.
В производстве минеральных удобрений
В молекулярной биологии ПАА используется в качестве поддерживающей среды для проведения гель-электрофореза белков и нуклеиновых кислот (т. н. ПААГ-электрофорез)[1][2]
Использование в нефтяной промышленности для заводнения пластов и проведения ремонтно-изоляционных работ в скважине
Полиакриламид используют в буровых растворах при нефтедобыче как регулятор водоотдачи и ингибитор реакции набухания глины.
Ссылки[править | править исходный текст]

↑ Gel electrophoresis
↑ PAAG электрофорез нативных белков | Практическая молекулярная биология
Категории: ПолиэлектролитыПолиакрилаты

Аура поцелуя[править | править исходный текст]

Полотно принадлежит к периоду творчества Климта, названному «золотым»: в это время художник много работал с золотым цветом и настоящим листовым сусальным золотом. Популярность картин этого времени, и «Поцелуя» в том числе, связана не в последнюю очередь с применением художником золота в качестве цвета. Золото с незапамятных времён вызывает магические, религиозные ассоциации в равной мере с чувством материальной ценности, значимости.
Толика этой ценности и ослепительное сияние, исходящего от золота, тесно соединяются с содержанием картины. Ценность картины как бы освещает её смысл. Стилистические свойства этого периода, характеризующиеся сокращением глубины пространства и орнаментальной плоскостью изображения, подчёркивают значение самого изображения и пространства на картине. Аура полотна и его завораживающая красота выражают, с одной стороны, его «ценность», с другой же представляют влюблённую пару как символ беззаботного эротического счастья.
На скале, на краю цветочной поляны, в золотой ауре, стоят полностью погружённые друг в друга, отгороженные от всего мира влюблённые. Из-за неопределённости места происходящего кажется, что изображённая на картине пара переходит в неподвластное времени и пространству космическое состояние, по ту сторону всех исторических и общественных стереотипов и катаклизмов. Полное уединение и повёрнутое назад лицо мужчины лишь подчеркивают впечатление изоляции и отрешённости по отношению к наблюдателю.
Картина часто описывалась критиками как «Союз» с указанием на орнаментальную символику одеяний мужчины и женщины. Однако сама символика опровергает это название: мужчине соответствуют, характерные его полу «жесткие» формы, прямоугольные бело-черно-серые поля, тогда как женщине «мягкие» формы, цветочные, пёстрые округлые элементы. Поэтому, хотя они и соединены посредством золотого одеяния, фона и объятия в единое целое, они все же отличаются друг от друга орнаментом. Однако эта разница является чисто символической и практически исчезает на фоне общей орнаментализации картины.
Ореол, окружающий слившихся воедино в поцелуе, определяется мужчиной, который своей спиной формирует его очертание. Его описывают как башне- или колоколоподобный, но в первую очередь — фаллическим. Подобные, более очевидные формы художник использовал в своих «Бетховенских Фризах». Этому главному символу мужского достоинства соответствует вирилитет мужчины. От него исходит вся энергия полотна. Это он обхватил своими руками голову женщины и повернул её к себе, чтобы поцеловать в щёку. В противоположность мужчине, женщина изображена на картине в пассивной роли. Она стоит преклонив колени — явный символ подчинённости. (При этом мужчина тоже стоит на коленях.)

«Портрет Адели Блох-Бауэр I» (1907) — картина Густава Климта. Известна также как «Золотая Адель» или «Австрийская Мона Лиза». Картина считается одним из самых значительных полотен Климта и австрийского Югендстиля в целом.
По сообщениям прессы в 2006 г. картина была приобретена за рекордную для произведения живописи сумму в 135 млн долларов. американским предпринимателем Рональдом Лаудером для основанной им Новой галереи в Нью-Йорке.


Портрет Адели Блох-Бауэр II, 1912
Содержание [убрать]
1 Описание
2 Модель — Адель Блох-Бауэр
3 История создания полотна
4 Техника и стиль
5 История полотна
6 Пять картин Климта, доставшихся по реституции Марии Альтман
7 Примечания
8 См. также
Описание[править | править исходный текст]

Лицо и руки, реалистично написанные в холодных тонах, являются визуальной доминантой в восприятии картины, выделяясь на фоне остальных элементов, исполненных орнаментально. Композиция полотна делится на две вертикальные части: справа изображена Адель Блох-Бауэр, левая часть почти пуста и содержит лишь намек на интерьер. Нижнюю треть полотна заполняет подол её платья. Густав Климт отказался от изображения перспективной глубины на картине, отдав предпочтение плоскостности. Орнаментальное золото фона вытесняет эскизно обозначенное пространство на задний план. Стены, кресло и платье модели оказываются просто двухмерными фигурами, расположенными рядом.
Обнаруживаемая при детальном рассмотрении изящная женская фигурка сидит в кресле. Свободного пространства над и под ней нет, она занимает всю вертикаль картины. Изображение головы кажется обрезанным вверху. Чёрные, убранные наверх волосы и непропорционально большой красный рот контрастируют с чрезвычайно бледной, почти бело-голубой карнацией. Женщина держит сцепленные в динамическом изгибе руки перед грудью и смотрит прямо на зрителя, чем достигается усиление визуального воздействия.
Поверх обтягивающего фигуру платья наброшена шаль. Она струится, расширяясь от рук к нижнему краю картины. Здесь также преобладают золотые тона. Декольте платья украшает тонкая кайма из прямоугольников и широкая полоса с двойным рядом треугольников. Затем использован узор из беспорядочно расположенных стилизованных глазков, вписанных в треугольники (см. символику «Всевидящего ока»). Накидка с орнаментом из спиралей, фигур-листьев и едва обозначенных складок кажется чуть светлее платья. Кресло, также золотое, выделяется на общем фоне только благодаря рисунку из спиралей — на нём полностью отсутствуют какие-либо тени, полутона или контуры. Небольшой салатово-зелёный фрагмент пола вносит цветовой акцент в общую гамму и помогает придать фигуре устойчивость.

Техника и стиль[править | править исходный текст]



Императрица Феодора. Мозаика в базилике Сан-Витале (фрагмент), Равенне, VI век
Портрет Адели Блох-Бауэр относится к золотому периоду в творчестве Климта. В 1903 г. во время поездки по Италии художника вдохновили богато украшенные золотом церковные мозаики в Равенне и Венеции, древний язык которых он перенёс в современные формы изобразительного искусства. Он экспериментировал с различными техниками живописи для того, чтобы придать поверхности своих работ новый облик. В дополнение к масляной живописи он использовал технику рельефа и позолоту.
Натуралистично изображены только лицо, плечи и руки. Интерьер вместе с развевающимся платьем и мебель лишь обозначены, переходя в орнамент, становится абстрактным и не даёт никакой пространственной ориентации, что отвечает колористической гамме и формам, используемым Климтом в 1898—1900 гг.
Климт восхищался византийским, минойским, микенским и египетским искусством, а также средневековой религиозной живописью Италии. Кроме того, в формах полотна отражается влияние модного в то время в Европе японского искусства гравюры Укиё-э и живописи эпохи Эдо. Не в последнюю очередь ощущаются и характерные черты французского импрессионизма, который был известен в Австрии во многом благодаря Венскому сецессиону — группе художников, к которой до 1905 года принадлежал и сам Климт.
Другие известные работы Климта: «Водяные змеи I», «Фриз Стокле» — заказ некоего бельгийского промышленника из Брюсселя, «Три возраста женщины», «Поцелуй», который вместе с «Золотой Аделью» составляют вершину творчества золотого периода Климта. Женщины были в эти годы главным мотивом в работах Климта.

История полотна[править | править исходный текст]



Чао, Адель. Вена, февраль 2006 г.
Готовый «Портрет Адели Блох-Бауэр I» в 1907 году был сразу выставлен в ателье художника в Вене и в этом же году появился в журнале «Немецкое искусство и декорация», а потом и на международной художественной выставке в Манхайме. В 1910 г. портрет находился в зале Климта в рамках IX международной экспозиции в Венеции. До 1918 г. портрет не выставлялся и находился в распоряжении Фердинанда и Адели Блох-Бауэр. С 1918 по 1921 гг. — в австрийской государственной галерее.
Адель Блох-Бауэр умерла 24 января 1925 г., оставив завещание, в котором просила своего мужа после его смерти передать два её портрета и четыре пейзажа кисти Густава Климта австрийской государственной галерее. При оглашении завещания её муж согласился выполнить волю покойной. Один из пейзажей — «Замок Каммер на озере Аттерзее III» он подарил в 1936 г. Австрийской галерее Бельведер. «Портрет Адели Блох-Бауэр I» в 1937 г. участвовал в выставке австрийского искусства в Париже и Берне.
Когда после аншлюса 12—13 марта 1938 года Австрия стала частью Третьего рейха, Фердинанд Блох-Бауэр бежал сначала в Чехословакию, а потом в Швейцарию. Картины вместе с большей частью его состояния остались в Австрии. В его летней резиденции Фердинанда Блох-Бауэра после аннексии Чехословакии жил Райнхард Гейдрих. Фердинанд Блох-Бауэр умер 13 ноября 1945 г. в Цюрихе. Перед смертью он отменил в своём завещании дарение картин австрийским музеям.
Его состояние и собрание живописи было экспроприировано нацистами. В 1941 г. австрийская галерея выкупила полотна Климта «Портрет Адели Блох-Бауэр I» и «Яблоня I». Поскольку у семьи Блох-Бауэр не было детей, то своими наследниками Фердинанд Блох-Бауэр назначил детей своего брата — Марию Альтман, Луизу Гутманн и Роберта Бентли. Незадолго до своей смерти он нанял венского адвоката Ринеша для защиты интересов наследников.
В 1998 г. в Австрия приняла Закон о реституции предметов искусства, который позволял любому гражданину запросить в музеях информацию о том, каким путём произведения искусства попали в их фонды (см. Реституция после Второй мировой войны частным лицам). Один из журналистов, изучавших музейные архивы, информировал Марию Альтман об обстоятельствах приобретения картин Климта австрийским государственным музеем. В 2005 г. после судебного процесса «Мария Альтман против Австрийской республики» картины были переданы законным владельцам [4].
После того как Австрия отказалась от права преимущественной покупки картин, пять картин Климта — «Портрет Адели Блох-Бауэр I», «Портрет Адели Блох-Бауэр II», «Березовая роща», «Яблоня I» и «Дома в Унтерахе близ Аттерзее», оцениваемые в 300 млн долларов, 14 февраля 2006 г. были привезены Лос-Анджелес, где Мария Альтман жила с 1942 г. 19 июня в газетах появилось сообщение о том, что Рональд Лаудер приобрел «Портрет Адели Блох-Бауэр I» за 135 млн долларов. Портрет с тех пор находится в основанной Лаудером Новой галерее в Нью-Йорке.

Реститу
ция (от лат. restitutio — восстановление).
В международном праве — форма материального возмещения ущерба в результате неправомерного международного акта путём восстановления состояния, существовавшего до его совершения. Может осуществляться различными способами.
В гражданском праве — последствие недействительности сделки, заключающееся в возврате сторонами всего полученного по сделке. При невозможности вернуть товарные ценности в натуральном виде возвращается их стоимость в денежном выражении.
Содержание [убрать]
1 Реституция национализированного имущества
2 Реституция перемещенных культурных ценностей
3 См. также
4 Примечания
5 Ссылки
Реституция национализированного имущества[править | править исходный текст]

В 1990-е годы в ряде стран Восточной Европы (Литва, Латвия, Эстония, Чехия, Польша, Болгария[1], Венгрия) были приняты законы о реституции национализированного в 1940-е годы имущества. В соответствии с ними бывшие собственники или их наследники вправе претендовать на передачу им государством в собственность объектов недвижимости. Отношение к этим законам в обществе неоднозначно.
В 1992 году США остановили оказание экономической помощи Никарагуа (начатое после прихода к власти проамериканского правительства В. Чаморро) и потребовали от правительства В. Чаморро "возвратить никарагуанским и американским владельцам" собственность, национализированную после победы Сандинистской революции, в период с 1979 по 1990 год[2].
На Украине в 2013 году представителями еврейской общины был поставлен вопрос о реституции собственности, принадлежавшей евреям в период до 1917 года[3].
В России также имеются сторонники реституции национализированного имущества, однако в связи с продолжительным периодом, прошедшим со времени национализации в 1917 году, эта идея значительной популярностью не пользуется и соответствующие законопроекты органами законодательной власти не рассматривались. Другим вариантом реституции в России, рассматривается признание недействительным итогов приватизации 1993-94 гг., и возвращения приватизированной собственности государству.

Реституция перемещенных культурных ценностей[править | править исходный текст]

Основная статья: Трофейное искусство
Одним из видов реституции является возвращение имущества, неправомерно захваченного и вывезенного одним из воюющих государств с территории другого государства, являющегося его военным противником. В случае невозможности возвратить всё неправомерно изъятое имущество допускается передача по договоренности такого же имущества или приблизительно равноценного вывезенному имуществу (субституция, или компенсаторная реституция).
Компенсаторная реституция — вид материальной международно-правовой ответственности государства-агрессора, применяемой в случаях, если осуществление ответственности данного государства в форме обычной реституции невозможно, и заключающейся в обязанности данного государства компенсировать причинённый другому государству материальный ущерб путём передачи потерпевшему государству (или путем изъятия потерпевшим государством в свою пользу) предметов того же рода, что и разграбленные и незаконно вывезенные государством-агрессором с территории потерпевшего государства.
Любые сделки в отношении неправомерно изъятого имущества, передача и вывоз его в третьи страны считаются недействительными, а само имущество подлежит возвращению государству, в чьём владении оно находилось до совершения международного правонарушения.
Международно-правовые акты, принятые в период и после окончания Второй мировой войны 1939—45, предусматривали возвращение в порядке реституции государствам, подвергшимся нападению и оккупации со стороны гитлеровской Германии и её союзников, огромных материальных ценностей, захваченных и незаконно вывезенных с временно оккупированных территорий. Вопрос о реституции ставился в 1947 в мирных договорах СССР с Финляндией, Италией, Венгрией, Румынией и Болгарией.
В конце XX века началось обсуждение вопроса о реституции в отношении ценностей, вывезенных СССР из побеждённой Германии в качестве трофеев и не оформленных как собственность советского государства в соответствии с нормами международного права. Мнения экспертов и политиков по поводу возможности возврата этих ценностей Германии разделились.

Междунаро
дно-правова
я отве
тственность — обязанность субъекта международного права ликвидировать вред, причинённый им другому субъекту международного права в результате нарушения международно-правового обязательства, или обязанность возместить материальный ущерб, причиненный в результате действий, не нарушающих нормы международного права, если такое возмещение предусматривается специальным международным договором (абсолютная ответственность).
Международная ответственность регулируется подотраслью международного права — правом международной ответственности.
Содержание [убрать]
1 История развития международной ответственности
2 Субъекты международной ответственности
2.1 Проблемы ответственности международных организаций
2.2 Проблема ответственности частных лиц в международном праве
3 Основания ответственности
4 Формы и виды ответственности
5 Обстоятельства, исключающие международную ответственность
6 Примечания
7 См. также
8 Литература
История развития международной ответственности[править | править исходный текст]

В Древнем мире субъектами международного права были не государства как таковые, а их властители[1]. В связи с жестокостью и крайней враждебностью между государствами, нормы о международной ответственности не получили развития и практически отсутствовали. Государство (в лице суверена) за нарушение обязательств по международному договору несло ответственность в форме военных действий, направленных против него, а также религиозных проклятий в отношении «вероломного» правителя[источник не указан 19 дней].


Версальский мирный договор (1919), в соответствии с которым на Германию были наложены репарации как меры международной ответственности
С развитием международного права в период Средневековья, нормы международной ответственности нашли закрепление в форме религиозных предписаний и санкций со стороны Папского престола. Средствами обеспечения исполнения международных обязательств выступали заложники, а также возможность наложения интердикта — отлучения от церкви, что стало первым инструментом наложения международной ответственности. Кроме того, получила развитие практика гарантирования исполнения международных договоров со стороны третьих государств или Папы Римского, а также залог городов и территорий. При заключении вестфальского мира немалое количество статей было посвящено реституции и коллективным санкциям против нарушителей новой международной системы отношений (ст. XVII Оснабрюкского договора).

Первое нормативное закрепление нормы о международно-правовой ответственности государств нашли в Гаагских конвенциях. Конвенцией 1907 года о законах и обычаях сухопутной войны в частности было установлено: «Воюющая Сторона, которая нарушит постановления сказанного Положения, должна будет возместить убытки, если к тому есть основание. Она будет ответственна за все действия, совершенные лицами, входящими в состав ее военных сил»[2]. Проблемам ответственности государств были посвящены также межамериканские конференции 1989-1890 и 1902 гг. Многие вопросы ответственности закреплялись на региональном, а ещё чаще, на уровне двусторонних договоров между государствами. Единой практики реализации ответственности не было.
Активизировало развитие норм о международной ответственности подписание Версальского мирного договора от 1919 года. В итоге его подписания на Германию были наложены меры международной ответственности в форме территориальных уступок, отказа от колоний, ограничений военных сил и репараций в размере 269 миллиардов золотых марок. Развитие международного права и необходимость его кодификации и принятия новых многосторонних конвенций привело к проведению в рамках Лиги Наций конференции по «прогрессивной кодификации международного права» на которой были затронуты и вопросы международно-правовой ответственности.
В 1927 году Институт международного права принял резолюцию «Международная ответственность государств за ущерб, причиненный на их территории личности или имуществу иностранцев»[3]. Однако, большинство норм относящихся к данному периоду развития института международной ответственности касались лишь ответственности государств за действия физических лиц.
Большое значение на формирование норм о международной ответственности оказало окончание Второй мировой войны,в частности Нюрнбергский и Токийский военные трибуналы. Уставы данных трибуналов определили основания ответственности высших должностных лиц государства. Основания, формы и виды ответственности государств впоследствии были закреплены в Уставе ООН[4]. Отдельные нормы о международной ответственности появились также в Конвенции по морскому праву ООН.
С 1953 года Комиссия международного права ООН начала разработку проектов Конвенций о международной ответственности государств, а также международной ответственности международных организаций. На сегодняшний день кодификация норм о международной ответственности продолжается. Важным достижением в данной сфере явилось принятие Генеральной Ассамблеей ООН 12 декабря 2001 года резолюции, которая в качестве приложения содержала документ «Ответственность государств за международно-противоправные деяния»[5]

Субъекты международной ответственности[править | править исходный текст]

Государства;
Международные организации;
Государственно-подобные образования (Святой Престол, Мальтийский орден);
Народы, борющиеся за независимость.
Проблемы ответственности международных организаций[править | править исходный текст]
По общему правилу, международная организация несёт ответственность за деяния своих полномочных лиц и агентов если они действуют при выполнении функций организации, а также полномочных лиц и агентов, предоставленных в распоряжение международной организации государством или другой международной организацией. Кроме того, международная организация несёт ответственность за иное деяние, которое признается и принимается международной организацией как собственное[6].
Однако, вопрос о самостоятельной международной ответственности международных организаций остается открытым. Согласно первой точке зрения (в основном поддерживавшейся советскими учеными),международная организация не может нести самостоятельную ответственность (особенно материальную) так как её бюджет складывается из взносов государств-членов (Ю.М. Колосов, Л.А. Моджорян, Е.А. Шибаева и др.)[источник не указан 19 дней]. В западной доктрине утверждается обратное[источник не указан 19 дней], хотя существует несколько подходов к данному вопросу, основанных на различном понимании концепции полномочий международной организации (Ф. Сейрстед, Г. Кельзен, Я. Броунли и др. )[7].
Несмотря на это, в современной науке международного права выделяют следующие проблемы в области ответственности международных организаций[источник не указан 19 дней]:
Проблема ответственности государств за деятельность организации в силу их участия в этой деятельности или членства в организации.
Проблема ответственности организации перед своими членами и не участвующими государствами.
Вопрос о присвоении противоправного деяния либо организации, либо государствам-членам, либо и той, и другим.
Проблема ответственности частных лиц в международном праве[править | править исходный текст]
По общему принципу индивиды, не будучи субъектами международного права, а будучи в случаях, когда международное право защищает их интересы, в частности, в случаях возмещения причиненного им ущерба, лишь дестинаторами его норм, не могут быть ни субъектами международного деликта, ни субъектами претензий об ответственности[8]. При этом, некоторые учёные придерживаются точки зрения, что частные лица являются субъектами международного права[9], а значит и субъектами международной ответственности. Однако, общепринятой считается точка зрения, что индивиды не являются субъектами международной ответственности, в частности, потому, что они несут персональную ответственность за совершенные международные преступления, а именно международную уголовную ответственность[10].

Основания ответственности[править | править исходный текст]

В теории международного права выделяют два основания международно-правовой ответственности:
Юридическое (на основании чего?) — это норма международного права, на основании которой субъект подлежит ответственности, или которые может нарушить. Данные нормы могут содержаться в любых источниках международного права и иных актах, фиксирующих обязательные для государства правила поведения. Ими являются договоры, обычаи, решения международных судов и арбитражей, обязательные акты международных организаций,, некоторые акты международных конференций и совещаний, отдельные односторонние акты государств международно-правового характера[11].
Фактическое (за что?) — это фактические действия (или бездействие) государства, которые включают в себя элементы состава правонарушения, то есть неправомерный характер, причинение ущерба и причинно-следственную связь между ними.
Формы и виды ответственности[править | править исходный текст]



Международный суд ООН — один из основных международных институтов, в полномочия которого входит наложение мер международной ответственности на государства
Международно-правовая ответственность реализуется в двух формах: материальной и нематериальной. К материальной ответственности относят, с определенными оговорками, следующие виды:
Репарации — возмещение причинённого вреда товарами, работами или услугами (см. компенсация)
Реституция — возвращение состояния в положение, существовавшее до совершения правонарушения. Примером реституции может служить освобождение незаконно задержанных лиц, возвращение противоправно конфискованного имущества, отмена незаконно предписанной судебной меры. Реституция не может применяться, если она является материально невозможной, или если она влечет за собой бремя, непропорциональное выгоде от реституции в сравнении с компенсацией[12]. Некоторые формы реституции могут иметь нематериальный характер, например, отмена закона или иного нормативного акта, противоречащего международному праву, отмена судебного решения, нарушившего права другого государства и т.д.
Компенсация — термин, используемый в современном международном праве для обозначения финансового возмещения материального ущерба или морального вреда. Компенсация может включать проценты с суммы, в которую оценивается причиненный ущерб. Компенсация является наиболее применяемой формой возмещения ущерба в международных отношениях[13].

К нематериальной ответственности относятся:
Сатисфакция — удовлетворение причиненного вреда (причиненного прежде всего международному престижу государства, его политическим интересам) нематериальными средствами. Обычно осуществляется в форме принесения официальных извинений, соболезнований, признания неправомерности собственных действий,а также может включать дисциплинарные меры или наказания в отношении тех лиц, действия которых стали причиной противоправного деяния[14]. Сатисфакция имеет место в тех случаях, когда причиненный вред не поддаётся финансовой оценке или нарушенные права невозможно восстановить материально, зачастую в дополнение к применению иных мер ответственности: компенсации, реституции[15]. Примерами сатисфакции международной организации является принесение НАТО официальных извинений Афганистану за гибель мирных жителей в результате бомбардировки в южной афганской провинции Гильменд[16][17]
Заверения или гарантии неповторения неправомерного деяния в будущем — данная форма близка к сатисфакции, иногда рассматривается как её разновидность[18].
Декларативные решения — констатация факта совершения правонарушения каким-либо официальным органом. Преобладает точка зрения, что это разновидность сатисфакции[19]. Так, Международный Суд ООН объявил в решении по делу об инциденте в проливе Корфу, что действия британского военно-морского флота по разминированию албанских вод без разрешения Албании являлись нарушением международного права, и что такое заявление отвечает просьбе, заявленной Албанией и само по себе является надлежащей сатисфакцией[20].
Из резолюции решения Международного суда ООН по делу об инциденте в проливе Корфу
Но чтобы обеспечить уважение к международному праву, органом которого он является, Суд должен заявить, что действия британского военно-морского флота составляют нарушение суверенитета Албании. Данное заявление делается в соответствии с просьбой, высказанной Албанией через своего поверенного, и само по себе является необходимым удовлетворением[21].

Ограничение суверенитета — оккупация территории государства; привлечение должностных лиц к ответственности и т.д. В современном международном праве возможно только в порядке осуществления международных санкций, введенных Советом Безопасности ООН, или в порядке осуществления процедуры в Международном уголовном суде или в специально созданных международных трибуналах, соответственно.
Обстоятельства, исключающие международную ответственность[править | править исходный текст]

Согласие полномочного органа или должностного лица одного государства на совершение конкретного деяния другим государством. Противоправность подобного деяния исключается в той мере, в которой оно не выходит за рамки данного согласия[22]. Аналогичное положение действует и в отношении международных организаций[23].
Самооборона принятая в соответствии с Уставом ООН. Если обращаться к Уставу ООН, то он закрепляет право на индивидуальную или коллективную самооборону как неотъемлемое право каждого государства. Для того, чтобы принятые меры являлись самообороной, необходимо, чтобы об их применении было немедленно сообщено Совету Безопасности, а сами действия не затрагивали полномочий Совета Безопасности[24].
Контрмеры, то есть такие деяния государства, которые являются противоправными, но лишаются такового статуса в связи с их использованием в ответ на противоправное деяние другого государства в целях прекращения такого действия или возмещения ущерба.
Форс-мажор — наступление такой ситуации, при которой субъект вынужден действовать вопреки международному обязательству в результате действия непреодолимой силы или не поддающегося контролю непредвиденного события[25]. Однако, действия государства не признаются обусловленными форс-мажорными обстоятельствами в случае, если:
форс-мажорная ситуация обусловлена, либо целиком, либо в сочетании с иными факторами, поведением государства, ссылающегося на неё.
государство приняло на себя риск возникновения такой ситуации[26].
Бедствие — ситуации, в которых представители и агенты государства не могут соблюдать международные обязательства в силу аварий и воздействия разрушительных сил природного и/или техногенного характера, не имея другой возможности спасти свою жизнь или жизнь вверенных лиц.
Состояние необходимости — только в случаях:
противоправное действие является единственным для государства путём защиты существенного интереса от серьезной и неминуемой опасности;
деяние не наносит серьезного ущерба существенным интересам определённого государства или государств, в отношении которых существует данное обязательство, или международного сообщества в целом[27].